本项研究PCE系统的开发和精准染色体编辑示意图。中国科学院遗传发育所 供图

　　这项攻克大片段DNA精准编辑的重要成果论文，北京时间8月4日深夜在国际知名学术期刊《细胞》(Cell)上线发表。审稿人评价认为，中国团队发表的研究工作，代表了基因工程领域的重大突破，在育种和基因治疗方面具有巨大的应用潜力。

　　系统应用受到3个关键问题制约

　　论文通讯作者高彩霞研究员介绍说，以基因编辑工具CRISPR及其衍生技术为代表的编辑系统，通过可编程的向导RNA(核糖核酸)引导Cas9等核酸酶靶向基因组特定位点，已广泛应用于特定碱基和短片段DNA的精准编辑。但针对大片段DNA编辑，现有工具在编辑效率、尺度、精准性及类型多样性等方面仍存在明显不足。

　　研究团队发现，位点特异性重组酶(Cre-Lox)系统具有染色体水平DNA操纵潜力，其原理是在基因组中引入Lox序列后，由Cre重组酶介导Lox位点之间的DNA重组来实现全基因组范围内的遗传操纵。

　　然而，Cre-Lox系统的应用受到3个关键问题的制约：Lox位点固有的对称性导致重组反应可逆，不利于目的编辑的发生；Cre酶作为四聚体工作，提升其活性的工程改造难度高；重组后特异性位点残留，影响编辑的精准性。

　　构建两个可编程染色体编辑系统

　　高彩霞指出，为逐一突破上述限制，在本项研究中，研究团队构建出系统性技术路径：首先，开发高通量重组位点快速改造平台，并提出不对称Lox位点设计原则，成功创制新型Lox变体，保持高效重组效率的同时将可逆重组活性降低至阴性对照水平。

　　其次，基于研究团队此前自主开发的融合蛋白通用逆折叠模型、结构与进化约束信息的蛋白定向进化平台AiCE，实现对Cre蛋白多聚化界面的精准优化，获得重组效率提升至3.5倍的工程化Cre蛋白变体。

　　最后，研究团队创建并优化了重组酶的无痕编辑策略Re-pegRNA，利用引导编辑器的高效编辑特性，通过设计特异性pegRNA对重组后残留的Lox位点进行“重引导编辑”，将其精准替换为原有基因组序列。

　　通过这三项技术的集成优化，研究团队成功构建PCE与RePCE两个可编程染色体编辑系统，可对不同Lox位点的插入位置和方向进行灵活编程，实现碱基从千比特(kb)到兆比特(Mb)尺度的大片段DNA精准无痕操纵。

　　研究团队表示，他们在动植物细胞中，利用新研发的系统已成功实现18.8　kb超大片段DNA的定点整合、5　kb序列的定向替换、12　Mb的染色体倒位、4　Mb的染色体删除及整条染色体的易位。他们还利用新型大片段DNA精准操纵技术，成功创制含315　kb精准倒位的抗除草剂水稻种质，展示出其广泛应用前景。

　　据了解，AiCE成果7月上旬已在线发表于《细胞》，并将与此次研究成果以背靠背形式于8月下旬在《细胞》纸质版正式刊出。(完)

【编辑:田博群】

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